Reduktion von „Out of Focus“ – Licht

Multiphotonmikroskopie

Im Wesentlichen funktioniert die Multiphotonenmikroskopie genauso wie die herkömmliche Fluoreszenzmikroskopie.

Nur erfolgt bei der normalen Fluoreszenzmikroskopie die Anregung durch 1 energiereiches kurzwelliges Photon, während bei der Multiphotonenmikroskopie die Anregungsenergie auf 2 oder 3 längerwellige Photonen aufgeteilt wird. Diese Photonen besitzen also nur die halbe oder nur ein Drittel der notwendigen Anregungsenergie. Je nach Anzahl der Photonen spricht man von 2-Photonenmikroskopie oder 3- Photonenmikroskopie.

Die einzelnen langwelligen Photonen haben jeweils zu wenig Energie um das Molekül in einen angeregten Zustand zu versetzen.

Um dennoch Fluoreszenz anzuregen, müssen 2 oder 3 Photonen nahezu gleichzeitig und in einem sehr kleinen Anregungsbereich zusammentreffen. Nur so kann sich die Energie der Photonen addieren und eine Anregung des Moleküls erfolgen.

Die Anregung erfolgt nur in dem kleinen Bereich in der Fokusebene wo die Photonen aufeinander treffen. Die Entstehung von Out of Focus Licht wird somit zur Gänze verhindert, und man erhält einen sehr hohen Kontrast und damit auch eine höhere Auflösung.

Für die Multiphotonenmikroskopie sind allerdings Objektive mit hoher numerischer Apertur sowie extrem leistungsstarke Infrarot-Laser notwendig.

Vorteile der Multiphotonmikroskopie

• Sehr große Eindringtiefe (≤700 μm)
  → daher auch für sehr dicke Objekte geeignet
• Ein Laser kann viele Farbstoffe anregen
• Auch UV-Farbstoffe anregbar
• Durch externe Detektoren sehr hohe Ausbeute
• Geringes Ausbleichen, da Anregungslicht nur in der Fokusebene absorbiert
• Wenig Strahlungsstreß durch energiearmes Anregungslicht
  → wichtig bei Objekten die durch kurzwelliges Laserlicht zerstört würden.

Nachteile der Multiphotonmikroskopie

• Sehr teurer IR-Laser
• Anregungseigenschaften für viele Farbstoffe nicht bekannt