Was ist Fluoreszenz Fluorochrome Fluoreszenzmikroskop CLSM

Farbstoffartefakte
in der Fluoreszenz-Mikroskopie

 

 

Bleaching

Durch die Anregung wird der Farbstoff zerstört und die Fluoreszenzintensität nimmt daher ständig ab. Dieses Ausbleichen der Farbstoffe ist jedoch nicht immer von Nachteil; es wird in speziellen Methoden wie FRAP oder FLIM auch gezielt eingesetzt.

 

Abhilfe

  • schnell und bei geringer Licht- oder Laserintensität arbeiten
  • Anti-Fading
    - Spezielle Medien verzögern das Bleaching
    - nur bei fixiertem Material möglich
    - im Notfall kann auch einfach Ascorbinsäure als Strahlenschutz verwendet werden

 

 

 

Quenching

Bei hoher Farbstoffkonzentration kann Energie strahlungsfrei zwischen Molekülen weitergegeben werden, sodass kaum Fluoreszenzlicht abgegeben wird.

 

Um dies zu vermeiden, soll immer mit möglichst geringer Farbstoffkonzentration gearbeitet werden.

 

Doch auch dieser Farbstoffartefakt kann für bestimmte Anwendungen gezielt eingesetzt werden:

  • Fluoreszenzmikroskopische Enzymnachweise
  • FRET

 

 

 

Cross-Talk / Bleed through

Werden mehrere Farbstoffe in einer Probe verwendet, können zwei Probleme auftreten:

Cross Talk
Bei ungenügender Trennung der Anregungswellenlängen kommt es zur gleichzeitigen Anregung beider Farbstoffe.

Bleed through
Bei ungenügender Trennung der Emissionswellenlängen können Farbstoffe vom Photomultiplier nicht mehr unterschieden werden.

 

 

 

Double Staining

In vielen Fällen wird die Probe mit zwei oder mehreren Farbstoffen behandelt oder das Objekt selbst besitzt eine Autofluoreszenz.

 

Um die unterschiedlichen Färbungen trennen zu können und einen Cross-Talk oder Bleed through zu vermeiden, müssen die Farbstoffe bestimmte Eigenschaften besitzen.

  • Die Farbstoffe können getrennt angeregt werden.
  • Die Emissionspektra sind deutlich getrennt.
  • Die Emissionspektra überschneiden sich, können aber rechnerisch getrennt werden.

Vor jedem Experiment muss auf Autofluoreszenz getestet
und ggf. ihr Einfluss ausgeschaltet werden!

 

 

 

 

Probleme beim Beladen

Beim Färben (Beladen) der Probe muss sichergestellt sein, dass der Farbstoff in die Zellen oder an die Strukturen gelangt, die er färben soll. Manche Farbstoffe benötigen auch eine bestimmte Umgebung, um eine Farbreaktion zu zeigen.

  • Membranpermeable Farbstoffe
  • Mikroinjektion
  • unpolare Farbstoff-Ester: Farbstoff wird in der Zelle erst durch Esterasen freigesetzt!!
  • Säure-Beladung: saurer Farbstoff ist in saurem Milieu ungeladen!!